《纯化宝典》,帮助大家在新学期
高效完成蛋白纯化实验。
今天推出的第一期,
就带来大家最关心的填料选择。
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纯化宝典之填料选择篇
对科研人来说,蛋白纯化是研究蛋白结构与功能的关键一步。虽然不用追求工业级的高产量,但对纯度的要求却格外严格——结构研究常常要 ≥95%,酶活实验也至少要 ≥90%。所以,纯化的第一目标就是“够纯”,在此基础上再兼顾收率和成本。
不同填料的分辨率、选择性、载量决定了分离效果,也影响你实验的成功与否。亲和、离子交换、疏水、多模式、反相、分子筛……各有优势,也对应不同纯化阶段。下面这张表格,帮你快速对照找到最合适的搭配。
表1: 不同层析填料的特征及在纯化阶段中的应用
其中,亲和层析基于其能与目的蛋白特异性结合,而不能与其他杂质蛋白结合的特性,因此有最好的选择性。但并非所有蛋白纯化都可选亲和层析,也不可能为每个目的蛋白都生产一款亲和填料。针对广泛应用的蛋白纯化标签,比如His、Fc、GST标签等,已有多种成熟的亲和填料。对于科研领域的蛋白纯化而言,亲和层析是最佳的选择。对于某些表达量较低纯化难度较大的蛋白,在表达时可以加入不止一个纯化标签,利用两步亲和层析进行高效纯化。
采用亲和层析时,需了解亲和作用的原理,针对可能影响纯化效果的因素,可在层析过程的样品调节、缓冲液选择、层析步骤等方面进行优化。接下来以应用广泛的His标签蛋白为例,介绍亲和层析使用的要点。
组氨酸 (His) 侧链上的咪唑基团能够与多种金属离子(如Ni2+、Co2+、Cu2+、Zn2+等)形成配位键并选择性结合,其中,Ni2+是纯化His标签蛋白的首选金属离子,也是目前使用最为广泛的金属离子。目前,使用较多的是以四价螯合的NTA亲和填料以及五价螯合的TED形式,其中TED形式螯合的Ni离子极为稳定,可以耐受还原剂和EDTA等螯合剂,适合哺乳动物细胞表达上清直接上样纯化和加入还原剂的复性溶液上样。选择其他金属离子进行纯化时,可以选择IMAC填料,自行螯合金属离子后再进行纯化。
表2:百林科不同螯合形式的填料特点介绍
使用Ni亲和时要注意:金属离子带正电,为避免非特异结合,缓冲液中要加一定浓度的NaCl;同时可以加入低浓度咪唑抑制非His标签主导的非特异性吸附。上样结合后也要用选择合适浓度的咪唑做淋洗(Wash),去除非特异性结合较弱的杂志蛋白,提高洗脱液中目的蛋白浓度。
案例一: 重组胶原蛋白纯化 样品信息:重组胶原蛋白 层析柱:Ni Chromstar® Excel (0.77*10 cm,柱体积CV=4.7ml) Buffer A:20 mM PB + 0.15 M NaCl (pH 7.5) Buffer B: 20 mM PB + 0.15 M NaCl (pH 7.5)+0.5M 咪唑(pH 7.5)
表3:重组胶原蛋白纯化详细步骤
图1、2:Ni填料层析图谱和胶图
表4:蛋白纯化中的常见小问题
如果亲和纯化后纯度还不够,可以接着用离子交换、疏水、多模式或分子筛层析进行精细纯化。 选哪种应当基于目的蛋白与杂质蛋白性质的差异选择合适的层析方式: 离子交换层析:等电点差异大 疏水层析:疏水性差异大 凝胶过滤层析:分子量差异大 多模式层析:单纯离子交换和疏水作用层析无法有效分离 反相层析:通常蛋白纯化中一般不选择,但在小分子多肽的纯化中可以选择 其中,离子交换层析操作便捷应用广泛,是除亲和外的首选纯化方式,尤其对蛋白性质差异无法做具体了解时,可以作为测试的首选。通常可以从SDS PAGE结果中发现分子量的差异,而且在亲和后的样品中带有标签的蛋白片段杂质也较为常见。 因此,分子筛层析在科研领域也有广泛的应用。除分子筛层析外的所有纯化方式都涉及pH或电导条件的改变,选择层析方式时应首先考虑目的蛋白的稳定性,确定可选择的层析方式和操作范围。
表5:百林科提供多种层析填料产品及预装柱,
其中粗体标注的产品适合科研领域的应用。
以离子交换为例,当目的蛋白带有净正电荷(溶液pH低于PI)时可以与阳离子交换层析填料(S, SP, CM)结合;反之,可以与阴离子交换层析填料(Q, DEAE)结合,根据蛋白稳定的pH范围和尽量增大目的蛋白与杂质蛋白带电荷差异两方面,选择合适的pH条件和对应的层析填料。样品需要在低电导时结合,提高盐浓度或改变pH时洗脱。初次实验时,蛋白结合后可以以线性梯度的方式,逐渐从低电导溶液过渡到高电导溶液,提高分辨率并找到去除杂质、洗脱目的蛋白的合适条件。
案例二: SP Chromstar® FF纯化胶原蛋白案例 样品:Ⅰ型胶原蛋白 分子量:300-400 kDa 等电点:7-9(理论) 来源:CHO细胞表达 平衡:50 mM HAc-NaAc,pH4.0,Cond 7.0 mS/cm 洗脱:50 mM HAc-NaAc+1 M NaCl,pH 4.0 RT=5 min
图3:Ⅰ型胶原蛋白层析图谱
分子筛填料基于分子量差异分离蛋白,通常不受溶液条件影响,但是精纯使用的分子筛填料与蛋白间存在弱的离子交换作用,一般在样品和溶液中加入一定浓度的盐进行屏蔽。为了实现较好的分辨率,上样量一般限制在柱体积的5%以内。
案例三: Geldex® 200 PG分离不同分子量的蛋白 层析柱: 16/600预装柱(Geldex® 200 PG) 样品: 肌红蛋白, 5.4 mg/mL, Mr 17 000 卵清蛋白, 36 mg/mL, Mr 44 000 HSA, 36 mg/mL, Mr 66 000 IgG, 2.8 mg/mL, Mr 158 000 马脾铁蛋白, 3.4 mg/mL, Mr 440 000 上样量: 500 μL 流速: 1 mL/min (30 cm/h) 缓冲液: 10 mM PB, 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.4 (PBS)
图4:不同分子量的蛋白层析图谱
不同层析模式的起始条件和结束条件不尽相同,在做不同层析间样品或最终产品的溶液置换(包括脱盐)时,可以选用Puredex® G25M。其蛋白分子量远大于各种盐离子,因此相比精纯的Geldex® 200PG等分子筛,脱盐时上样量可达到柱体积的25%。
表6:不同层析模式的
起始条件和结束条件
案例四:Puredex® G-25M脱盐 填料:Puredex® G-25M 层析柱:Chrom-LinX® 26/400 (H=34 cm),柱体积170ml 样品:某蛋白样品(~750 kd) 样品体积:20 ml,12%柱体积 流速:8 mL/min,90 cm/h 缓冲液:10 mM 醋酸-醋酸钠,pH 6.0
图5:某蛋白样品层析图谱
综上所述,科研领域蛋白纯化的首选是亲和层析,离子交换层析和分子筛也有较多的应用。纯化工艺并没有固定的范式,需要根据目的蛋白与杂质的情况选择多种层析模式进行组合。篇幅有限并不能详述每种层析的细节,如有需要请联系对应的销售和技术,百林科随时提供技术及产品的支持。
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