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大规模细胞培养如何解决CO₂累积问题


生物制药上游生产一般采用哺乳动物细胞表达,大多数细胞的适宜pH在7.0左右,且溶解的二氧化碳浓度(dCO₂)在5%至15%之间。当dCO₂超过15%(即115mmHg)时,会抑制细胞生长、导致细胞代谢状态改变、生产力下降以及影响蛋白质的翻译后修饰。在生物反应器的工艺放大过程中,经典的策略是:恒定的单位体积功率(P/V)和恒定的叶尖线速度控制搅拌转速,根据氧气的KLa效率选择鼓泡孔径,以及恒定的单位体积气体流量(vvm)来设定气体流速。然而,这些方法仅侧重于将生物反应器系统中的剪切力保持在最低水平,并未考虑将dCO₂浓度控制在期望范围内,易导致培养工艺放大失败。因此,如何将dCO₂浓度维持在合适范围内,也是一个需要重点考虑的因素。



dCO₂产生和累积的原因


在细胞培养早期阶段,通过底通CO₂来保持pH值。而随着细胞密度的增加,细胞生长和产物的表达需要消耗氧气和能量(如分解葡萄糖和乳酸),进而产生大量的CO₂。由于放大过程中,经常考虑相同条件下的流体剪切力、气泡、泡沫等因素,会减小搅拌转速和通气速率,这就导致了dCO₂移除效率降低。而且为了提高氧气的溶解效率,通常会采用微泡通气,以增加气液接触面积、提高氧传递系数,但气泡直径减小,CO₂移除效率也会随之降低等,以上原因是导致反应器中CO₂的产生和移除效率降低,最终导致反应器中CO₂积累。



dCO₂的控制方法


外源物添加

可通过在培养过程中添加外源物质减少CO₂的产生和累积,如在培养过程中常用来控制pH的碱液NaHCO₃,可用Na₂CO₃或NaOH溶液代替,同时在培养基中的NaHCO₃缓冲溶液可以考虑用组氨酸、亚氨基乙二酸、MOPS、TES、 TRIZMA或PIPES替换。


反应器设计与选择

反应器的高径比(液体高度与罐体直径比:HL/DT)一般为1-3。在对生物反应器进行放大过程中,随着液体高度不断增加,同时静水压力也随之增加。由于气体的扩散系数与压力成反比,即生物反应器高度的增加会导致总压力增加、扩散系数减小,那么CO₂从培养基液相扩散到气相中的速率就会降低,同时反应器高度的增加,CO₂在反应器中的上升路径也变长,就导致CO₂比较难移除。同时若反应器的高径比过小,会影响反应器的搅拌和通气效果。因此选择合适的高径比,对CO₂的移除是事半功倍的。如下图所示,在反应器高径比为1.5的情况下,不同体积生物反应器的液体高度增加及相应的CO₂溶解度增加的变化关系。

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图1:不同体积反应器中CO₂的溶解度


鼓泡移除

反应器中的CO₂在气相(气泡)和液相(培养基)之间存在浓度差,CO₂会由液相向气相进行传递,最后随着气泡溢出液面而脱离,气泡移除是解决细胞培养过程中dCO₂积累常用并且有效的方法。通常底部鼓泡更大、上升速度更快、停留时间更短有利于二氧化碳的移除。但在经典的细胞培养工艺中,为了满足高密度细胞生长需求,通常使用微孔气体分布器增加O₂的KLa,但这不利于CO₂的移除。下图显示了气泡上升速度随气泡直径变化的函数关系,其中小于0.1mm的气泡被称为微泡,上升速度较低,因为此时气泡的运动主要受到液体表面张力的影响,导致停留时间更长,移除CO₂的效率变差。解决方法是通过控制分布器的气体流速使气泡的停留时间低于其饱和的时间。因此,在大规模细胞培养中根据不同的细胞的需求,选择合适的气泡孔径和通气速率,在满足氧气KLa的同时,实现CO₂的有效去除。


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图2:鼓泡孔径与上升速度的关系



百林科生物反应器对dCO₂去除的优化设计


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图3:百林科CytoLinX® BR 一次性罐体式生物反应器10-2000L


高效气体传质

采用偏心搅拌和桨叶结构设计,降低剪切力,提高反应器内的混匀效率,利于CO₂的移除。在经典的微泡和大泡基础上,推出中泡的设计理念,实现反应器内气体的高效传质。


相似结构,放大无忧

从10到2000L结构相似,1.5:1的高径比设计,助力CO₂快速移除,轻松实现细胞培养工艺规模放大。


灵活整合PAT工具

采用稳定的PCS7系统设计,可实现全厂设备控制。扩展整合pCO₂电极,实现细胞培养过程中dCO₂的过程监控与控制。



参考文献

1. Muralidharan, N., Johnson, T., Bolduc, E., & Davis, M. (2024). CO₂ Control Strategy for Large-Scale Cell Culture Bioreactor Operation. Advances in Bioscience and Bioengineering, 12(1), 1-13. https://doi.org/10.11648/abb.20241201.11

2. 郑兵兵.动物细胞培养用生物反应器内流体混合及气液传质特性研究[D].华东理工大学,2013.


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