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Protein A亲和填料的清洁和寿命


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得益于Protein A 亲和填料对抗体的高选择性体积去除率以及稳健的杂质去除效果。Protein A 亲和填料作为抗体药生产的行业标准。由于Protein A结合能力的局限性以及与Protein A树脂相关的高成本,提高填料使用寿命的需求变得尤为重要。一般认为Protein A 填料的重复使用寿命由填料水解和填料污垢两个因子所影响。

Protein A填料水解是指配基长时间暴露在清洁溶液(如氢氧化钠)中的降解。Protein A填料污垢是由于使用无效清洗液导致杂质在填料表面不断积累导致。


 填料配基水解(hydrolysis)

将全新的填料用不同浓度的碱性溶液循环 >250 小时来检测Protein A配基的水解速率,评估不同氢氧化钠的浓度和温度,用填料的DBC的下降数据来指征Protein A的填料水解速率。从图1 中可看到,高浓度的氢氧化钠导致更高的配基水解速率,此外低温能缓解一定的配基水解。


图11新新.png

图1,氢氧化钠浓度和温度对DBC的影响

以上数据表明在低温条件下可缓解配基水解速率,不同分子的DBC对低温具有不同的敏感性。以7个模型蛋白作为代表来研究不同分子在不同温度下的DBC,其中分子B是pI为7.9的Fc融合蛋白,其余为pI范围为6.5-8.9的IgG1单克隆抗体。如图2,可以看到不同分子对低温有不同程度的载量降低,这在一定程度上将抵消低温下对配基水解带来的好处。同时,在生产过程中在冷环境内进行Protein A层析清晰步骤还可能在层析柱上产生放气效应(outgassing),不利于生产制造,所以低温下氢氧化钠清洗并不是理想的解决方案。


图2新新.png

图2,使用添加剂来延缓配基的水解

选定不同的添加剂对配基水解具有不同的延缓效果,以分子E为代表,分别添加蔗糖、乙二醇和丙二醇作为氢氧化钠的添加剂,评估其清洁液循环之后的DBC。由图3可知,添加剂对配基水解的延缓有一定的作用,丙二醇/蔗糖和乙二醇的配体稳定性分别比0.1 M NaOH的基础情况提高了2倍和3倍。


图33新新.png

图3,比较碱性清洁溶液和

非碱性清洁溶液的填料污垢

选定3种分子(1个单抗+2个Fc融合蛋白)做为代表研究填料清洗后的污垢。为了最大程度上污染层析柱,3个代表分子的澄清收获液在Protein A的层析柱上进行10个cycle,每个cycle只做到洗脱步骤,没有做层析柱清洁,最后将层析柱拆下来分装,分别用不同清洗液在不同温度下孵育2小时,并用平衡液清洗3次,用原始的填料作为对照。此时填料上残余的是清洗不干净的污垢。将最后的填料悬浮液稀释到1倍的SDS PAGE loading buffer中,80℃孵育10分钟后取上清并进行SDS PAGE分析。SDS PAGE上越多蛋白表示越多的清洗不干净的污垢。


从图4中可以清楚地看出,0.1M和0.3M(泳道2、4、5)浓度较高的氢氧化钠作为清洁溶液的效果明显优于0.02M (泳道3)。这一趋势在所有3种测试分子中都是一致的。0.3M NaOH对分子A的反应优于0.1M NaOH,但对其他两种情况的反应相当。此外,pH 11非碱清洗液(泳道 6)对分子A的清洗效果良好,但对其他分子的清洗效果不佳。这支持了无碱清洗液不适合作为平台清洗策略的理论。有趣的是,温度并没有影响树脂清洗的效率。在更高浓度的氢氧化钠(0.3M)下,在环境温度和低温(泳道4和5)下都获得了类似的结果。

图4.png图4

为了更好表征清洗时间对清洗效果,继续以分子B为代表(Fc融合蛋白,pI 7.9), 用B分子污染的填料分别不同孵育时间。如图5所示,随着孵育时间增加,泳道的蛋白越少,清洗效果越好。但是增加孵育时间可能导致更多的配基降解,所以孵育时间和配基降解应该综合考虑以取得最佳的填料寿命。

图5.png

图5,填料寿命研究


根据以上数据,选定0.1 M NaOH和0.1 M NaOH+20% EtGly为清洁溶液,评估其使用次数。由图6可知,在添加了20% EthGly情况下层析柱寿命几乎翻了一倍,且产品质量未见下降。使用乙二醇作为添加剂来清洁亲和层析柱会导致洗脱体积随着循环数增加而缓慢增加,洗脱体积不影响相应的产品质量,所以乙二醇任然可以作为亲和层析的清洁添加剂。

图6新.png

图6

百林科Protein A 亲和层析介质MaXtar® ARPA,采用的高耐碱性的蛋白A配基,具有完全的自主知识产权,采用创新的绿色化学成球工艺、偶联方式、配基,具有卓越的耐碱性能。在每个循环均使用0.5M NaOH,15min进行CIP处理,运行200个cycle以后,其动态结合载量(DBC)依然保留其原始载量的90%以上。

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图7

参考文献:

Zhang J, Siva S, Caple R, Ghose S, Gronke R. Maximizing the functional lifetime of Protein A resins. Biotechnol Prog. 2017 May;33(3):708-715. doi: 10.1002/btpr.2448. Epub 2017 Mar 20. PMID: 28218470.


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