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抗体片段纯化全攻略:从捕获到精纯,高效策略助力研发提速


抗体片段(如Fab、F(ab')₂、scFv、dAb等)是通过酶解或基因工程  改造获得的抗体功能片段。



抗体片段相比完整抗体

   有以下核心优势:


1、体积小,渗透力强

Fab片段(约50 kDa)、scFv(25–30 kDa)、VHH(约15 kDa)等分子量显著低于完整抗体(150 kDa),可高效穿透致密组织(如实体瘤)及血脑屏障,提升靶向递送效率‌。


2、减少空间位阻

小体积避免了大分子在固相检测中的空间阻碍,提升了抗原结合灵敏度(如ELISA、免疫组化)‌。


3、消除Fc介导的非特异性结合

抗体片段缺乏Fc区,避免了与巨噬细胞、NK细胞等表面的Fc受体结合,降低了实验背景噪音(尤其富含Fc受体的组织)‌。


4、保留高亲和力

虽为单价(Fab、scFv)或双价(F(ab')₂),仍能通过优化保持与完整抗体相当的抗原结合能力‌。


5、多功能工程化改造‌

靶向治疗载体‌:可偶联毒素、放射性核素或药物,精准杀伤肿瘤细胞(如免疫毒素)‌。

  • 构建双/多特异性分子‌:scFv或VHH易组装成双抗、三抗,同步靶向多个抗原表位‌。

  • CAR-T细胞疗法‌:scFv常用作CAR的抗原识别域,增强肿瘤靶向性‌。


6、生产成本低,表达简便

无需糖基化修饰,可在原核系统(如大肠杆菌)高效表达,缩短生产周期‌。


7、免疫原性低

由于缺乏种属特异性Fc区,因而降低了体内治疗时引发免疫反应(如HAMA反应)的风险‌。




常见抗体片段类型及纯化挑战:


1、常见片段类型

  • Fab片段‌:含VH-CH1和VL-CL结构域,保留单价结合能力(约50 kDa)。

  •  scFv‌:VH与VL通过短肽连接(25–27 kDa),无Fc区。

  • dAb(单域抗体)‌:仅含VH或VL结构域(12–15 kDa),稳定性高,但亲和力可能受限。‌

  • 双特异性片段‌:如BiTE(双特异性T细胞衔接器),需解决错配和聚集问题。‌


2、核心挑战

  • 无Fc区:无法使用Protein A/G等经典亲和层析。

  • 稳定性差:易聚集或降解,需温和纯化条件。

  • 杂质复杂性:宿主蛋白(HCP)、核酸及错误折叠片段残留。




抗体片段层析策略:

抗体片段的纯化策略可以参考完整抗体常见的三步法捕获阶段(Capture)+中间纯化(Intermediate Purification)+精纯阶段(Polishing)。


1. 捕获阶段(Capture)

捕获阶段由于抗体片段大多无FC区,因此需选择具有特定的区域结合位点的填料产品来对目标物进行结合捕获。

图片1更新.jpg

百林科的MaXtar® ProteinLMaXtar® InnovA得益于其特定的区域结合位点因此可以较好的捕获纯化Fab、ScFV、VHH等片段抗体。


案例1:MaXtar® ProteinL捕获ScFV案例分享—ScFV纯化

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MaXtar®  Protein L纯化单域抗体

图表1.jpg

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小结:MaXtar® Protein L纯化后,纯度和回收率表现均符合预期。


案例2:

MaXtar® ProteinL结合Fab


案例分享—Fab结合


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MaXtar®  Protein L结合Fab抗体

图表2.jpg

表2.jpg

小结:MaXtar® Protein L纯化后,纯度和回收率表现均符合预期。


案例3:

MaXtar® InnovA纯化VHH 


案例分享—VHH纯化

55更新.jpg

图表1.jpg


2. 中间纯化(Intermediate Purification)

& 精纯阶段(Polishing)

‌目标‌:去除非目标产物,确保单体纯度。控制电荷变体及相关HCP/HCD残留。


中间纯化和精纯阶段可参考完整抗体的工艺选择,通常使用阴阳离子即可获得较好的纯度、收率结果以及残留的控制;对于较为复杂并且电荷性质与目标物接近的杂质可以选择复合模式或者疏水这类拥有其他功能性的产品进行分离。



‌离子交换层析(IEC)‌:

  • 阳离子交换(CEX)‌:在低pH(4.0–5.5)结合,盐梯度洗脱(如MaXtar® S HC Pro & MaXtar® SP HR)。‌

  • 阴离子交换(AEX)‌:流穿模式(pH 7.0–9.0)去除DNA/内毒素(如MaXtar® Q & MaXtar® Q HR)‌。


‌疏水相互作用层析(HIC)‌:

高盐结合(1–2 M硫酸铵),低盐洗脱,有效分离疏水性聚集物(如MaXtar® Phenyl HR & MaXtar® Butyl HR)。


复合模式层析‌:

结合离子交换与疏水作用,分辨率高(如去除Fab片段中的错配产物),在低pH(4.0–5.5)结合,盐梯度&PH单梯度或双梯度洗脱(如MaXtar® MMC HR)。‌


本文封面来源于站酷海洛


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