电荷异构体、聚体片段与碎片
电荷异构体、聚体与片段是抗体药物的关键质量参数,其产生会影响抗体药物的功效。
1. 电荷异构体
电荷异构体是抗体分子的分子量,疏水性及电荷差异造成的异质性,一般分为酸性异构体和碱性异构体。其产生主要原因是与翻译后的修饰有关。电荷异构体宏观表现为在等电聚焦电泳图上出现弥散或者多个条带,离子交换色谱图主峰前后出现小峰。
酸性电荷异构体:主要由二硫键错配,三硫键形成,赖氨酸糖基化,天冬酰胺的去酰化;
碱性电荷异构体:天冬氨酸异构化,脯氨酸酰基化,C端赖氨酸,N端焦谷氨酸的形成。
电荷异构可能会影响抗体的稳定性、药效、免疫原性、药代动力学,特征性的识别和分离电荷异构体是至关重要的。
2. 聚体
聚体是由抗体分子间通过共价键或氢键等分子间作用力形成的聚合物,是由两个或多个蛋白组成的复合物,其形成过程十分复杂。包括: 蛋白结构破坏,形成不可逆的聚合物;两个抗体结合形成二聚体,并可能在此基础上继续增加单体,形成多聚;单抗未正确折叠,错误折叠,正确折叠都可形成聚体;二硫键也可能形成聚体。
3. 碎片
碎片是由于蛋白的氨基酸序列的局部结构,溶剂条件以及金属或自由基的存在而发生肽键降解,从而使抗体产生碎片。
电荷异构体、聚体与碎片的
下游层析去除方法
电荷异构体、聚体与碎片的去除策略需要结合离子交换层析及洗脱模式,及上游工艺控制等多维度来进行筛选。本文不考虑上游工艺的优化,着重围绕层析方法及洗脱模式的去除方法,以降低或减少电荷异构体、聚体与碎片。
1. IEC
依据不同电荷异构体的pI差异,通过条件洗脱液的pH或盐浓度梯度分离电荷异构体及聚集体。例如,酸性异构体在低pH下结合较弱,可以优先洗脱;碱性异构体则需要提高pH或盐浓度以增强结合选择性;阳离子层析(MaXtar® S HC),在盐和pH双梯度分离酸碱异构体可以达到较理想的纯化效果,如图1(下滑查看)。
2. MMC
MMC具有弱阳离子与疏水层析两种层析机理,具有离子交换、疏水作用及氢键等作用,复合层析(MaXtar® MMC HR)在离子交换层析模式下,可同时去除电荷异构体和聚集体,如图2(下滑查看)。
3. HIC
疏水层析根抗体的疏水性差异进行分离。在高盐浓度下,疏水残基暴露,与疏水填料表面结合,随盐浓度的降低,使得不同疏水强度抗体进行分离。在缓冲液添加PEG或精氨酸可改善聚体的效果。
实验一:
层析条件:
Buffer A:20mM HAc, 20mM PB, 20mM Tris,pH5.5;
Buffer B:20mM HAc, 20mM PB, 20mM Tris, 1M NaCl,pH8.0。
层析填料:
MaXtar® S HC Column:100×7.7mm I.D.,4.7ml/CV;
Sample:1.74ms/cm,pH5.5。
实验图谱:
图1:MaXtar® S HC
去除抗体的酸碱电荷异构体
表1:MaXtar® S HC
去除抗体的酸碱电荷异构体数据汇总
实验二: 层析条件: Buffer A:50mM NaAc-HAc,pH5.5; Buffer B:50mM NaAc-HAc+1M NaCl,pH5.5。 层析填料: MaXtar® MMC HR Column:100×7.7mm I.D.,4.7ml/CV; Sample:双抗cond 3ms/cm,pH5.5(<20mg/ml)。 实验图谱:
图2:MaXtar® MMC HR
去除抗体的酸碱电荷异构体和聚体
表2:MaXtar® MMC HR
去除抗体的酸碱电荷异构体和聚体数据汇总
层析控制策略 在抗体药物下游纯化过程中,选择合适的层析步骤以去除电荷结构体、聚体与片段,对于工艺开发和控制,尤其重要。比如:阳离子离子交换层析(MaXtar® S HC),复合层析(MaXtar® MMC、MaXtar® MMC HR)的阳离子层析模式下对于电荷异构体效果明显;疏水层析,阳离子交换层析对于二聚体及更高的聚集体纯化效果更明显,而阴离子层析(MaXtar® Q HR、MaXtar® Q)对于抗体片段的去除效果更理想。
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