重组干扰素纯化工艺流程

重组干扰素（rIFN）是利用基因工程重组 DNA 技术，由大肠杆菌 / CHO 细胞表达纯化的细胞因子，具备广谱抗病毒、抑制细胞增殖、多重免疫调节三大核心活性；按亚型分为α、β、γ三大类，临床以 α 系列用量最大。

利用大肠杆菌生产的重组干扰素，虽然成本低、产量高，却常因形成包涵体而“失活”，蛋白聚成一团，天然构象全无。

因此，包涵体的高效复性，是整个纯化工艺的“命门”。下面，我们就一步步拆解这条经典流程，利用我们百林科的两款填料：

Ni Chromstar^® Excel
ChromaX^® Puredex^® G25M

可完成整个流程的纯化，并重点看看层析复性技术如何破局。

常规复性步骤

第一步：细胞破碎，拿到包涵体沉淀

重悬：菌体按 1:10（g:mL）加入 20mM PB + 0.2M NaCl，充分混匀。
破碎：900 bar 高压均质 2~3 次，让细胞彻底破裂。
离心：8000 rpm，30 min，弃上清，沉淀就是粗包涵体。

洗涤（两次）：

第一次用 20mM PB、0.2M NaCl、2M Urea、1% Triton X-100，按 1:20 重悬，离心收集沉淀；

第二次去掉 Triton，只用 20mM PB、0.2M NaCl、2M Urea，再次离心收集。

洗涤的目的是去除细胞碎片和部分杂蛋白，为后续复性打基础。

第二步：包涵体溶解 + Ni 柱层析复性纯化

溶解

将洗涤后的沉淀用 50mM Tris、0.5M NaCl、8M Urea（pH8.0）按 1:15 重悬，4°C 搅拌过夜（约 20h），然后 4°C 下 8000 rpm 离心 30 min，取上清并抽滤，得到变性蛋白溶液。

Ni 柱上的“边复性边纯化”

这一步是我们的重点！利用固定化金属亲和层析（IMAC），在柱上实现变性剂去除和蛋白折叠，同时捕获带 His 标签的目标蛋白

表1.png

表1：纯化流程

注意：复性缓冲液中保留了 Arg（精氨酸）抑制聚集，GSH/GSSG 提供氧化还原环境，帮助二硫键正确配对。梯度洗脱时，咪唑竞争性置换目标蛋白，同时完成纯化。

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图1：Ni Chromstar^® Excel 层析图谱

第三步： G25层析换液，获得原液成品

将 Ni 柱洗脱的收集样品，上样到 G25 层析柱，用20mM PB（pH7.0）进行缓冲液置换，同时去除残留微量杂质和聚集体，最终得到高纯度、高活性的重组干扰素原液。

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图2：Puredex^® G25M 层析图谱

工艺难点与突破：为什么选择层析复性？

传统复性方法（稀释法、透析法）操作简单，但蛋白极易在过程中沉淀聚集，复性效率通常只有 5%~20%，令人头疼。

而层析复性技术（如本工艺中的 Ni 柱复性）则优势明显：

变性剂缓慢移除，蛋白在柱上逐步折叠，减少分子间碰撞；
同时完成复性和纯化，一步多用；
产物浓度高、活性回收率显著提升。

近年来，这种“纯化+复性”一体化策略，已成为重组蛋白制备的热门方向。

从细胞破碎到包涵体洗涤，从溶解上柱到梯度复性，再到 SEC 精纯，每一步都关乎最终产品的质量和活性。而柱上复性，正是我们破解低效难题的关键一招。我们百林科生产的Ni Chromstar^® Excel这款填料是改良琼脂糖基架层析介质，它具备耐受性好，化学稳定性好等诸多优点。我们的Puredex^® G25M 也具有耐受有机溶剂，化学稳定性好等优点。

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