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RSV 疫苗四类纯化工艺方案解析


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呼吸道合胞病毒 (Respiratory Syncyial Virus,RSV) 是一种反式单链RNA病毒,共编码11种蛋白,其中G和F表面蛋白在RSV吸附和融合过程中发挥重要作用,是产生中和抗体最重要的抗原位点,也是诱导机体产生免疫原性和抗病毒的最主要靶点。感染呼吸道合胞病毒会导致黏液分泌增加及发炎,导致气道变窄,是引起婴幼儿、老年人及免疫功能缺陷患者下呼吸道感染的重要病原体。

RSV的基因组全长为15.2 Kb,编码11个病毒蛋白,其中病毒包膜上有三种蛋白:粘附蛋白G、融合蛋白F和小疏水蛋白SH。G和F蛋白在病毒感染过程中起核心作用,因此在RSV疫苗开发中,主要针对G蛋白和F蛋白开展抗原设计。


目前RSV疫苗的研发主要集中在四大类,包括减毒活疫苗、病毒载体疫苗、重组亚单位疫苗和核酸疫苗。本文总结了四种类型的RSV疫苗的纯化工艺方案。



减毒活疫苗

将收获的病毒液经过核酸酶处理和过滤澄清后,利用层析填料MaXtar® COLL 700填料进行纯化,以高效去除宿主蛋白和核酸。此工艺相比传统分子筛层析具有高上样量(可达10 CV)的优点,MaXtar® COLL 700流穿液采用300 KDa的中空纤维膜柱进行浓缩和换液。此工艺整体的回收率为50~60%。

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RSV病毒载体疫苗

用于RSV疫苗的病毒载体类型主要有腺病毒载体和痘病毒载体。其中,已批准上市的腺病毒载体新冠疫苗具有较为成熟的生产工艺。


以腺病毒载体为例,可采用以下工艺:

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RSV重组亚单位疫苗

适合疫苗开发的F蛋白具有两种构象,即融合前F蛋白 (Pre-F) 和融合后F蛋白 (Post-F),早期疫苗产品都是基于Post-F蛋白设计的,诱导产生的中和抗体滴度低,不足以抵抗RSV感染。直到2013年,Pre-F构象被解析后,以Pre-F为基础的RSV疫苗研发进入快速发展阶段。


以制备F蛋白为例,可采用以下工艺过程:经CHO细胞培养,收获上清并澄清,可经过病毒灭活和初步层析捕获后,利用离子交换填料MaXtar® Q和复合模式层析MaXtar® MMA进行精细纯化,有效去除宿主蛋白和核酸,同时确保RSV Pre-F蛋白的纯度。随后进行纳滤、超滤和除菌过滤获得抗原原液。


方案一更新1.png


第二个方案,则采用百林科三步填料纯化法MaXtar® MMC初步层析捕+MaXtar® Q+MaXtar® Butyl HR,纯度可达到99.5%.

方案2更新1.png



第一步MaXtar® MMC层析

  1. Sample source:BW243250108BRU01E(pH7.16,Cond:2.38ms/cm)

  2. Resin:MaXtar® MMC;Column:100×7.7mm,Volume:4.7mL

  3. Sample:BW243250110BRO01L

  4. Capacity:5.78g/L,RT:4.7min


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第二步MaXtar® Q 层析

  1. Sample source:BW243250116BRO01E01(pH7.04,Cond:13.67ms/cm)

  2. Resin:MaXtar® Q;Column:100×7.7mm,Volume:4.7mL

  3. Sample:BW243250117BRN01L(pH7.51,Cond:3.94ms/cm)

  4. Capacity:g/L,RT:4.7min


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第三步层析 MaXtar® Butyl HR

  1. Sample source:BW243250117BRN01E01(pH7.39,Cond:17.07ms/cm)

  2. Resin:MaXtar® Butyl HR;Column:100×7.7mm,Volume:4.7mL

  3. Sample:BW243250117BRH01L(pH7.10,Cond:169.83ms/cm,16mL)

  4. Capacity:g/L,RT:4.7min

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RSV mRNA疫苗

mRNA类疫苗工艺包括了质粒模板的制备、mRNA的合成与纯化、LNP的制备及无菌灌装等步骤。质粒的制备工艺可以选择百林科的经典三步法工艺和改进两步法工艺:

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mRNA纯化工艺一般采用 Oligo DT etc亲和层析进行捕获,去除工艺相关杂质(酶类、NTP及模板DNA等)。捕获阶段除了用亲和层析,还可以选用复合模式层析填料MaXtar® COLL 700,该工艺具有高的回收率及更低的杂质含量优点。


精细纯化可以选择高分辨率强阴离子交换填料如MaXtar® Q HR,也可以选择高分辨率疏水填料MaXtar® phenyl HR 或MaXtar® Butyl HR,去除片段或dsRNA等产品相关杂质。

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综上,目前我们在RSV项目的纯化上积累了丰富的工艺开发经验。百林科作为生物工艺关键设备与耗材的供应商,在提供层析介质的同时,也提供相应的层析设备及层析柱,超滤系统以及其他相关产品和应用服务,欢迎大家垂询。 


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