层层精纯，只为一支好疫苗：流感疫苗下游纯化工艺技术深度解析

前言

流感是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，每年导致全球约10亿人感染，其中重症病例300万~500万例，相关死亡病例29万~65万例。据世界卫生组织报告，流感每年可导致5%~10%的成人和20%~30%的儿童发病，造成严重的疾病负担。

接种疫苗是预防和控制流感病毒感染及其严重并发症的最有效手段。然而，流感病毒的快速变异特性——包括抗原漂移（点突变积累）和抗原转换（基因重配），使得疫苗必须每年更新组分，这对生产工艺提出了极高要求。

从病毒培养到最终成品，下游纯化工艺是决定疫苗安全性、有效性和生产效率的核心环节。如果说上游培养是“种庄稼”，下游纯化就是“去皮壳、碾精米”的过程——去粗取精，只留下最有效的保护成分。

流感病毒与疫苗发展概况

1、流感病毒的分类与结构

流感病毒属于正粘病毒科，根据核蛋白和基质蛋白的不同，主要分为甲（A）、乙（B）、丙（C）、丁（D）四型：

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表1：流感疫苗的分类与结构

甲型流感病毒根据表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的不同分为多种亚型。目前已发现18种HA亚型（H1-H18）和11种NA亚型（N1-N11），其中在人类中广泛流行的主要有H1N1、H2N2和H3N2亚型。

HA是病毒表面的主要糖蛋白，由球状头部结构域和茎部结构域组成，介导病毒与宿主细胞表面唾液酸受体的结合，是产生中和抗体的关键抗原。NA则是四聚体糖蛋白，通过切割唾液酸促进新生病毒颗粒的释放，是抗病毒药物（奥司他韦、扎那米韦等）的靶点。

2、流感疫苗发展简史

流感疫苗的研发与应用已有近百年历史，其发展历程如下：

1933年：首次分离到甲型流感病毒A(H1N1)亚型
20世纪30年代中期：研发第一种流感疫苗——鸡胚生产的灭活甲型流感疫苗
1940年：分离到B型流感病毒
1942年：成功研发包括A(H1N1)和B型的二价灭活流感疫苗
1968年：甲型流感病毒H3N2大流行，提出三价灭活流感疫苗需求；同年，裂解疫苗在美国获批
1976~1977年：在裂解疫苗基础上提取纯化HA和NA抗原，成功研发亚单位疫苗，1980年在英国首先获批
1978年：三价灭活流感疫苗在美国批准上市
2000年后：佐剂疫苗（MF59、AS03）、高剂量疫苗Fluzone相继开发
2012年：美国FDA批准四价流感裂解疫苗Fluarix
2013年：美国FDA批准重组蛋白三价流感疫苗FluBlok

3、流感病毒的变异性与疫苗更新的挑战

流感病毒具有高度变异性，主要通过两种机制：

抗原漂移：由于RNA聚合酶缺乏校正功能，病毒基因组在复制过程中发生点突变积累，导致抗原性微小变化，是引起季节性流感的主要原因。
抗原转换：两种不同亚型的流感病毒同时感染同一宿主时发生基因重配，产生全新的亚型，由于人群缺乏免疫力，可导致流感大流行。

20世纪以来，共发生四次流感大流行：1918年西班牙流感（H1N1）、1957年亚洲流感（H2N2）、1968年香港流感（H3N2）和2009年甲型H1N1流感。

这种抗原变异性使得疫苗毒株与当年流行毒株的抗原性并不完全匹配，导致流感疫苗的有效性降低。美国2009~2010年至2019~2020年流感季节的疫苗有效性介于19%~60%，通常当A(H3N2)为优势株时有效性较低。

自1973年起，世界卫生组织根据全球监测系统和对最有可能传播的流感毒株的预测，发布关于流感疫苗组分的建议；自1999年起，每年分别就北半球和南半球提出疫苗组分建议。

4、全球流感疫苗市场格局主要疫苗类型

主要疫苗类型

表2：疫苗类型及代表产品

灭活流感疫苗：包括全病毒灭活疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗。由于临床安全性高、免疫效果好且生产成本低，使其成为最常见的流感疫苗。裂解疫苗采用去污剂（如Triton X-100、聚山梨酯80）破坏病毒包膜，而亚单位疫苗则进一步纯化，仅保留HA和NA抗原。
减毒活流感疫苗：能激发黏膜、全身体液和细胞免疫反应，尤其儿童免疫后能形成长期的免疫记忆。目前在美国获批用于2-49岁人群，在加拿大用于2-59岁人群，在欧盟和英国用于2-17岁人群。
重组流感疫苗：采用昆虫细胞-杆状病毒表达系统生产重组HA蛋白，在生产速度、可扩展性、生物安全性和抗原可靠性方面具有优势。2013年获批用于18岁以上人群，2016年扩展至50岁及以上人群，2025年3月获批扩展至9-17岁青少年。

中国流感疫苗市场

中国批准上市的流感疫苗包括三价灭活流感疫苗、四价灭活流感疫苗和三价减毒活流感疫苗。近期多个重磅产品获批或进入临床：

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表3：中国疫苗市场进展

5、全球主要流感疫苗产品一览

根据Gupta和Mohan的综述（2023），全球已上市的流感疫苗主要包括：

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表4、5：全球疫苗产品概览

研发前沿：下一代流感疫苗的技术路线

1、mRNA疫苗：突破性进展

Moderna的mRNA-1010季节性流感疫苗已在美国、欧洲、加拿大、澳大利亚提交上市申请。针对H5大流行流感毒株的mRNA-1018候选疫苗，已获得流行病防范创新联盟（CEPI）高达5430万美元资助，将于2026年初启动III期临床研究。如果获批上市，将成为全球首个基于mRNA技术的大流行流感疫苗。

与传统疫苗相比，mRNA疫苗的生产周期更短，无需处理活病毒，生物安全要求低，且可快速应对新发毒株。

2、广谱/通用疫苗：终极目标

美国NIAID已启动一项I期临床试验（NCT07340047），评估H1ssF（H1 HA稳定茎部铁蛋白纳米颗粒）疫苗候选物，与已上市的细胞基质疫苗Flucelvax进行头对头比较。这类“通用疫苗”有望覆盖多种流感亚型，提供更持久的保护。

根据Li等（2025）发表于《Animal Diseases》的综述，目前通用疫苗的研发策略主要聚焦于保守抗原靶点：

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表6：不同抗原靶点优劣势

3、基于NA的疫苗：被忽视的靶点

HA是流感疫苗的免疫优势抗原，但近年来NA作为疫苗靶点重新受到关注。Hoxie等（2024）在Vaccine发表的研究表明，基于重组N2神经氨酸酶（N2-MPP）联合CpG 1018佐剂和铝佐剂的疫苗，在小鼠和仓鼠模型中可诱导广谱保护性免疫。

研究显示，N2-MPP+CpG+铝佐剂组诱导的抗体可抑制多种异源N2亚型流感病毒的酶活性，对氨基酸序列同源性低至76.33%的毒株仍具有交叉抑制活性。

4、通用流感疫苗的新型递送平台

新一代疫苗的创新平台结合通用流感疫苗设计，可以激发比传统流感疫苗更好的免疫反应：

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表7：新型流感疫苗递送平台

mRNA疫苗在新型冠状病毒感染大流行中已显示出非常高的功效，其在流感疫苗领域的应用前景广阔。Moderna的mRNA-1010季节性流感疫苗已在美国、欧洲、加拿大、澳大利亚提交上市申请；针对H5大流行流感毒株的mRNA-1018候选疫苗已获CEPI资助，将于2026年初启动III期临床。

病毒样颗粒能以自然构象呈递抗原，产生更好的免疫反应。由M2蛋白、NA和IL-12组成的嵌合细胞因子的病毒样颗粒通用流感疫苗，成功诱导了针对A型流感病毒同源和异源亚型感染的有效交叉保护反应。

纳米颗粒是高密度表达抗原并提供佐剂样功能的递送平台。基于蛋白纳米颗粒介导的重组流感血凝素递送能够增强免疫原性、抗体反应的广度，并维持Th1和Th2平衡。美国NIAID的H1ssF（H1 HA稳定茎部铁蛋白纳米颗粒）疫苗已完成I期临床。

5、WHO的愿景：改进型流感疫苗

世界卫生组织最新发布的《改进型流感疫苗全面价值评估》指出，2025-2050年间，广泛使用改进型流感疫苗可预防66-180亿额外流感病例，减少230-620万死亡。下一代疫苗的目标是更强的免疫原性、更广的保护范围和更好的生产可及性。

流感疫苗的纯化工艺深度解析

1、鸡胚流感疫苗的纯化工艺

工艺概述

鸡胚流感疫苗是最传统的生产工艺，已有70余年历史。其原料是接种流感病毒后收获的鸡胚尿囊液，目标产物是流感病毒颗粒，主要杂质包括卵清蛋白、鸡胚蛋白、尿囊液成分等。

关键工艺步骤

初步澄清：收获的尿囊液首先通过低速离心（3000-6000g）或深层过滤（3-0.45μm）去除鸡胚组织碎片和血细胞。研究表明，6000g离心30min可获得较好的澄清效果，但深层过滤在浊度控制和工艺放大方面更具优势。
超滤浓缩：采用截留分子量300-1000kD的超滤膜包对病毒液进行浓缩，病毒回收率可达90%左右。缓冲液盐浓度对病毒回收率影响不大，但需与后续层析条件匹配。
核心纯化：

蔗糖密度梯度离心：传统方法，利用病毒与杂质在离心力场中的密度差异进行分离。病毒颗粒密度约为1.18-1.20g/cm³，在蔗糖梯度中形成特征性条带。该方法分辨率高，但难以连续化生产，处理量有限。

凝胶过滤层析：现代工艺越来越多地引入Sepharose 4FF等凝胶过滤填料，根据分子大小进行分离。流感病毒颗粒分子量约数百MDa，远大于杂蛋白，因此在凝胶柱中优先流穿。研究表明，相比离心法，凝胶过滤层析可将病毒回收率从19%提升至70%以上。

应用案例

在某客户的鸡胚流感项目的国产填料替换的实验中，百林科的Chromstar^® 4FF表现优异，得到客户信赖。针对4个型别的流感病毒，分别进行3个填料批次的测试，检测血凝素回收率及除杂效果。

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表8：Chromstar^® 4FF测试数据

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图1：纯化图谱

结果显示，百林科的Chromstar^® 4FF效果比肩与其现有工艺的进口品牌，3个批次的填料均能重现一致的工艺，表明百林科填料的批间一致性较好。

2、细胞基质流感疫苗的纯化工艺

工艺挑战

细胞基质流感疫苗采用MDCK、Vero或PER.C6等传代细胞培养病毒，解决了鸡胚疫苗的多项痛点。然而，细胞基质引入的宿主细胞蛋白和宿主细胞DNA成为新的挑战。特别是MDCK细胞具有成瘤性，因此对DNA残留的要求极为严格（<100pg/剂）。

关键工艺步骤

初步澄清：采用深层过滤（3-0.45μm）去除细胞碎片，病毒回收率约95%，优于离心法。
核酸酶处理：加入Benzonase核酸酶（终浓度50U/mL），37℃处理2h，主动降解宿主DNA。研究表明，此条件可使DNA去除率达93.5%以上，且对病毒血凝滴度无明显影响。
Benzonase是一种非特异性核酸内切酶，可在链内任意核苷酸位点切割，将DNA消化为3-8个碱基的寡核苷酸片段，从而被后续层析有效去除。
超滤浓缩：采用300kD孔径超滤膜包进行浓缩和洗滤，病毒回收率>90%。
一步层析——双壳层复合模式：
第一步层析为双壳层的复合填料的流穿模式层析，带负电的杂质被吸附在填料内部，而病毒颗粒则在流穿液中，能去除绝大部分的HCP和部分的宿主DNA。
二步层析——阴离子交换精纯：

应用案例

用百林科的Q Chromstar^® XL阴离子交换层析作为精纯步骤。

以A1株型为例，百林科Q Chromstar^® XL的收集液的检测结果如下：

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表9：检测结果

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图2：Q Chromstar^® XL阴离子交换层析图

3、重组HA疫苗的纯化工艺（Flublok案例）

表达系统

Flublok采用昆虫细胞（expresSF+细胞）——杆状病毒表达系统生产重组HA蛋白。该系统的优势在于：昆虫细胞可在无血清培养基中悬浮培养，可规模化至450L，同时杆状病毒宿主范围狭窄，不感染脊椎动物，生物安全性高。每年更换疫苗株时无需重新建立稳转细胞系，只需重组杆状病毒。

生产工艺流程

根据Holtz等和Wang等的文献，Flublok的生产流程如下：接种病毒后，28℃培养48-72h。最后低速离心收集细胞沉淀，弃上清（HA定位于细胞膜）。细胞沉淀重悬于50mM乙醇胺+0.3M NaCl+0.1%β-ME，pH9.0，去除胞质和外周膜蛋白再以50mM乙醇胺+0.1%β-ME洗涤，最后以50mM乙醇胺+1% Triton X-100+0.1%β-ME，pH9.0提取膜蛋白，提取效率>60%

层析纯化：

阴离子交换层析：平衡缓冲液50mM乙醇胺+0.1% Triton X-100+0.01%β-ME，pH9.0。HA流穿，杂质结合后以0.2-2.0M NaCl洗脱。
亲和层析（Lectin）：平衡缓冲液0.5M NaCl+50mM乙醇胺+0.1% Triton X-100+0.01%β-ME，pH9.0。Lentil Lectin特异性结合α-D-甘露糖基和α-D-葡萄糖基，HA结合后以0.5M N-甲基-α-D-吡喃甘露糖苷洗脱。
阳离子交换层析：平衡缓冲液20mM Tris+0.1% Triton X-100+0.01%β-ME，pH7.4。HA结合后以10mM磷酸钠+0.01% Tween-20置换去污剂，再以150mM NaCl+10mM磷酸钠+0.01% Tween-20，pH7.4洗脱。

工艺性能：从10-45L发酵规模，可获得2-4mg/L纯化HA，纯度>95%，总收率57%。

04、亚单位流感疫苗的纯化工艺

亚单位疫苗是在裂解的基础上，进一步纯化，只保留病毒表面最关键的两种有效抗原成分——HA和NA，而去除病毒内部的蛋白质和遗传物质。中逸安科的专利公开了一种三价流感病毒亚单位疫苗的制备方法，将裂解剂加入后直接进行蔗糖梯度离心，边裂解边离心。离心收获液采用凝胶过滤方式脱盐和缓冲液置换。最终产品的HA含量>80%，且不含佐剂和防腐剂，保证了产品的有效性和安全性。

挑战与展望

流感疫苗开发面临的巨大挑战是如何解决抗原变异株的频繁出现以及流感病毒的快速变异率。这个至关重要问题的一个潜在解决办法是开发出具有最大保护作用的通用流感疫苗。

各国研究者已经研制出多种针对流感病毒不同靶点的候选通用疫苗，在动物模型和临床阶段显示出良好的安全性和免疫原性，使得开发通用流感疫苗具有乐观的前景。但目前使用的中和抗体滴度来评估疫苗效力不足以评估通用流感疫苗的广度，需要加入细胞免疫和非中和抗体水平的保护相关性研究。

从纯化工艺角度，传统鸡胚工艺通过凝胶过滤层析将病毒回收率从19%提升至70%；细胞基质工艺采用复合模式层析和离子交换层析两步法，实现DNA去除率>99.3%；重组HA工艺通过三步层析获得纯度>95%的HA抗原；亚单位工艺通过裂解与超速离心同步进行，简化流程并提高纯度。

展望未来，随着mRNA技术、广谱疫苗和基于NA的疫苗等新平台的发展，纯化工艺将面临新的挑战与机遇。但可以确定的是，“去除杂质，保留有效抗原”是永恒的主题。正是这些不断革新的技术，为我们筑起了一道道抵御流感病毒的安全防线。

参考文献

1. 汪立杰, 黄维金, 王佑春. 通用流感疫苗研发进展[J]. 中国食品药品监管, 2023(05):18-23.

2. 罗丹. MDCK细胞基质流感疫苗纯化工艺研究[D]. 武汉生物制品研究所, 2020.

3. Cox MM, Hollister JR. FluBlok, a next generation influenza vaccine manufactured in insect cells. Biologicals. 2009;37(3):182-189.

4. Cox MM, Hashimoto Y. A fast track influenza virus vaccine produced in insect cells. J Invertebr Pathol. 2011;107 Suppl:S31-41.

5. Holtz KM, Anderson DK, Cox MM. Production of a recombinant influenza vaccine using the baculovirus expression vector system. Bioprocess J. 2003;2:65-73.

6. Wang K, Holtz KM, Anderson K, et al. Expression and purification of an influenza hemagglutinin—one step closer to a recombinant protein-based influenza vaccine. Vaccine. 2006;24(12):2176-2185.

7. Li M, Guo P, Song H, et al. Development of universal influenza vaccines: strategies for broadly cross-reactive influenza vaccine responses. Animal Diseases. 2025;5:33.

8. Gupta D, Mohan S. Influenza vaccine: a review on current scenario and future prospects. J Genet Eng Biotechnol. 2023;21(1):154.

9. Hoxie I, Vasilev K, Clark JJ, et al. A recombinant N2 neuraminidase-based CpG 1018® adjuvanted vaccine provides protection against challenge with heterologous influenza viruses in mice and hamsters. Vaccine. 2024;42(26):126269.

10. 中逸安科生物技术股份有限公司. 一种三价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法: CN201610459672.8[P]. 2018-01-05.

11. FDA. Clinical Review Memorandum: Flublok Quadrivalent (STN 125285/613). March 19, 2025.

（本文综合公开文献及专利，旨在交流疫苗纯化工艺技术，供行业参考。）

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