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双抗纯化难?这篇攻略帮你搞定复杂杂质分离!


近年来,双特异性抗体(bsAbs)在肿瘤免疫治疗领域持续火热。截至2025年底,全球已有19款双抗药物获批上市,超过300项临床试验正在开展中[1]。然而,双抗分子结构复杂——轻链错配、同源二聚体、半抗、聚集体等产品相关杂质层出不穷,给下游纯化带来巨大挑战。


作为层析填料供应商,百林科深知:传统的单抗纯化工艺难以直接套用于双抗。今天,我们就从填料选型的角度,聊聊双抗纯化的那些事。



双抗纯化的核心难点:

杂质太多、太像


双抗分子根据结构可分为含Fc区的IgG-like型和不含Fc区的Non IgG-like型。 对于IgG-like型双抗,特别是非对称结构(如knobs-into-holes),由于涉及两条不同的重链和轻链共表达,理论上可能产生超过10种副产物,包括:同源二聚体(homodimer)、半抗(half antibody)、轻链缺失产物(LC-missing byproduct)、聚集体(aggregate)等等。


更棘手的是,这些杂质与目标分子的物理化学性质(pI、疏水性等)非常接近,常规的离子交换层析往往难以实现有效分离。



填料选型策略:

三步法为主,疏水、多模式是关键


目前双抗纯化仍以经典三步层析为框架:亲和捕获 → 精纯I → 精纯II。但在具体填料选择上,需要根据双抗结构特点灵活调整。



Step 1:亲和捕获——Protein A仍是主力


对于含Fc区的双抗,Protein A亲和层析依然是捕获阶段的首选。以MaXtar® InnovA Pro为例,其动态结合载量可达70 mg hIgG/mL填料(保留时间6分钟),且支持0.5-1.0M NaOH在位清洁,显著提升工艺经济性。对于酸敏感抗体,可以选择MaXtar® HipHA,温和条件下仍可以高效洗脱抗体。


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 图1.MaXtar® HipHA某双抗层析谱图,洗脱pH 4.0


表1(1).png


表1:MaXtar® HipHA层析谱图及质量数据



Step 2-3:精纯阶段——多种模式显神通


对于复杂产品的相关杂质,就需要各种模式的层析填料出场了,下表列出了常见的杂质类型与推荐的层析方法。

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表2:常见的杂质类型与推荐的层析方法


案例1:疏水层析去除聚体


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图2、3:MaXtar® Phenyl HR

某双抗层析谱图及质量数据


MaXtar® Phenyl HR对聚体去除效果显著,样品纯度由95.41%提升至99.40%,聚体含量则由4.59%下降至0.60%。



案例2:疏水层析去除同源二聚体


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图4 & 表3.MaXtar® Phenyl HR

某双抗层析谱图及质量数据


MaXtar® Phenyl HR对homodimer去除效果显著,样品纯度由51.8%提升至87.7%,hole-hole则由16.5%下降至3.6%。


案例3:离子层析去除低分子量杂质

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图5 & 表4.MaXtar® SP HR

某双抗层析谱图及质量数据


MaXtar® SP HR对LMW去除效果显著,样品纯度由92.8%提升至99.7%,LMW则由7.14%下降至0.27%。


案例4:多模式层析去除酸碱异构体


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图6 & 表5:MaXtar® MMC HR

某双抗层析谱图及质量数据


MaXtar® MMC HR去除酸碱异构体效果显著,主峰纯度由53%提升至66%,酸峰则由45%下降至33%。


总结

双特异性抗体的纯化确实比单抗更具挑战性,但通过合理的填料选型和工艺优化,完全可以实现高纯度、高收率的分离目标。




参考文献

【1】医药魔方NextPharma数据库


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