重组蛋白层析：从捕获到精纯的核心策略

重组蛋白在现代生物医药（如治疗性抗体、酶、疫苗、细胞因子）、诊断试剂和工业酶制剂等领域占据核心地位。其生产过程通常涉及基因工程改造的宿主细胞（如大肠杆菌、CHO细胞、酵母、昆虫细胞）进行表达，随后从复杂的细胞培养物或裂解液中分离纯化目标蛋白。层析技术以其高分辨率、高选择性和良好的可放大性，成为重组蛋白纯化工艺的基石。开发一个稳健、高效、经济且符合法规要求的层析纯化工艺，需要系统性的策略。

工艺开发的核心目标

高纯度：有效去除宿主细胞蛋白（HCP）、核酸（DNA/RNA）、内毒素、病毒（如适用）、培养基成分、产品相关杂质（聚集体、降解片段、错误折叠形式、翻译后修饰变体等）。
高回收率：最大化目标蛋白的收率，降低生产成本。
稳健性：工艺对原材料（如缓冲液、填料）的微小变化、操作参数的波动具有耐受性。
可放大性：实验室规模开发的工艺能成功放大到中试和生产规模。
经济性：优化工艺步骤、减少层析步骤数量、提高填料载量和使用寿命、降低缓冲液消耗。
合规性：满足药品生产质量管理规范（GMP）要求，具备良好的工艺表征（PC）和工艺验证（PV）基础，确保产品质量和安全性（特别是病毒清除能力）。
速度：缩短纯化周期时间，提高生产效率。

层析工艺开发策略框架

阶段 1：前期研究与目标定义

深入了解目标蛋白：

物理化学性质：分子量、等电点（pI）、疏水性、稳定性（pH、温度、氧化还原、剪切力）、翻译后修饰（糖基化、磷酸化等）。
生物学活性：功能检测方法。
关键质量属性（CQAs）：直接影响产品安全性和有效性的属性（纯度、活性、聚集体含量、电荷异质性、糖型分布、宿主杂质残留、内毒素、病毒颗粒等）。
表达系统与收获液特性：宿主细胞类型（决定主要杂质谱）、表达形式（胞内、分泌、包涵体）、收获液/裂解液的组成、粘度、颗粒物含量。

明确工艺目标：

设定纯度和收率目标、成本上限、时间要求、放大规模目标、法规要求（如病毒清除要求）。

文献调研与平台借鉴：

参考同类蛋白的纯化策略，利用已有的平台技术（如单抗的Protein A平台）。

阶段 2：捕获阶段开发

目标：快速浓缩目标蛋白，去除大部分体积和主要杂质（如细胞碎片、核酸、脂质、大部分HCP），稳定目标蛋白。

首选技术：

亲和层析是捕获阶段的黄金标准（如果可用且经济）

单抗/FC融合蛋白： Protein A/G/L亲和层析。开发重点：结合/洗脱条件优化（pH、离子强度、添加剂）、载量优化、清洗/再生方案、聚集体控制、Protein A配体脱落。
标签融合蛋白：His-Tag (IMAC), GST-Tag, FLAG-Tag等。开发重点：结合特异性、洗脱条件（咪唑浓度、还原剂、pH）、标签去除策略（如酶切）、潜在的标签相关杂质。

替代技术（当亲和层析不适用时）：

离子交换层析 (IEX)：强阴离子交换（如MaXtar^® Q, Q Chromstar® FF）常用于捕获带负电荷的杂质（核酸、酸性HCP），使目标蛋白流穿；或根据等电点pI选择。
结疏水相互作用层析 (HIC)：在高盐下结合目标蛋白或杂质。对盐浓度敏感。
沉淀/絮凝：有时用于初步浓缩和杂质去除（如核酸沉淀），作为层析前的预处理。

案例1：重组亚单位带状疱疹项目采用MaXtar^® Q 结合洗脱模式，20%B洗杂，35%洗脱目标蛋白。

层析柱及填料：直径为2.6 cm，高度20 cm
样品：培养上清。目的蛋白浓度为0.7 mg/mL
上样体积：804 mL
溶液A：20 mM PB pH6.8
溶液B：20 mM PB 1M NaCl pH6.8
流速：120 cm/h
梯度：20%洗杂，35%洗脱

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捕获阶段开发要点：

高载量和高流速：选择大颗粒、高流速耐受性好的填料。
预过滤/澄清：优化深层过滤、离心或切向流过滤（TFF）以去除颗粒物，保护层析柱。
样品调整：优化pH、电导、添加剂（如蛋白酶抑制剂、还原剂）以促进结合和稳定性。
流穿模式 vs. 结合-洗脱模式：根据杂质谱和目标蛋白性质选择。

阶段 3：中间纯化阶段开发

目标：去除与目标蛋白性质相近的关键杂质（如HCP、聚集体、错配异构体、脱落的亲和配体、宿主DNA）。

核心技术：离子交换层析 (IEX) 和疏水相互作用层析 (HIC) 是最常用的中间纯化步骤，利用电荷或疏水性差异进行分离。通常与捕获步骤正交（不同的分离原理）。

IEX：精细优化pH（在目标蛋白pI附近操作以最大化电荷差异）、梯度洗脱或阶跃洗脱条件、缓冲液种类和离子强度。阳离子交换（如MaXtar^® S, SP Chromstar^®）和阴离子交换（如MaXtar^® Q, Q Chromstar^® ）的选择取决于目标蛋白的pI和杂质谱。

HIC：优化盐种类（通常硫酸铵）、起始盐浓度、梯度或阶跃洗脱条件、添加剂。在高盐下结合，降低盐浓度洗脱。对去除聚集体效果较好。

其他技术：

混合模式层析 (MMC)：结合多种作用力（如离子交换+疏水/氢键），选择性可能更高，但机理更复杂，开发难度略大（如MaXtar^® MMC）。
羟基磷灰石层析 (HAP)：对某些难分离的杂质（如脱落的Protein A、DNA、聚集体）有独特效果。

案例2：重组亚单位带状疱疹项目第二步粗纯采用Phenyl Chromstar^® HP 结合洗脱模式，30%B洗杂，70%B洗脱目的蛋白。

层析柱及填料：直径为2.6 cm，高度13. 8 cm
样品：MaXtar^® Q洗脱收集液（加入硫酸铵至电导为98-105 ms/cm），样品浓度为1.86 mg/mL
上样体积：218 mL
溶液A：0.6M (NH4)2SO4·PBS
溶液B：水
流速：120 cm/h
梯度：30%洗杂，70%洗脱

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阶段 4：精纯化阶段开发

目标：去除痕量杂质（特别是与目标蛋白性质极其接近的杂质，如微量HCP、产品相关变体、二聚体/寡聚体），最终达到所需的高纯度标准。通常也是关键的病毒清除步骤（对于哺乳动物细胞表达产品）。

核心技术：

离子交换层析 (IEX)：在更精细的条件下（更浅梯度、更高分辨率填料）进行最终纯化，分离电荷异构体
尺寸排阻层析 (SEC)：基于分子量差异分离，是去除聚集体（尤其是高分子量聚集体）和降解片段的金标准，同时可置换缓冲液。缺点是处理速度慢、载量低、样品被稀释。常用于最终步骤或分析。
阴离子交换层析流穿模式：作为精纯步骤，利用大部分HCP和病毒颗粒带负电的特性，在高pH下（>pI）使目标蛋白流穿，杂质结合在柱上。

案列3：重组亚单位带状疱疹项目第三步精纯层析采用SP Chromstar^® FF流穿模式进一步去除杂质。

层析柱及填料：直径为2.6 cm，高度10 cm
样品：超滤后溶液，浓度为0.9 mg/mL
上样体积：178 mL
溶液A：20 mM PB pH5.8
溶液B：20 mM PB 1M NaCl
流速：60 cm/h
梯度：流穿模式

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关键成功因素与挑战

深度理解目标蛋白和杂质谱：是选择正确分离方法的基础。利用分析技术（HPLC, CE, SDS-PAGE, Western Blot, MS, SEC-MALS等）全程监控。

正交性原则：组合使用基于不同分离原理的层析模式是达到高纯度的关键。

平台化策略：对于相似类别的产品（如单抗），采用标准化平台工艺可极大加速开发。

质量源于设计 (QbD)：从开发早期就融入QbD理念，关注CQAs，进行风险评估（如FMEA），利用DoE优化，定义设计空间。

病毒安全：哺乳动物细胞产品的工艺必须包含并验证至少两种具有不同机理、强效的病毒清除/灭活步骤（通常为低pH孵育 + AEX流穿 + 纳米过滤）。

成本控制：层析填料和消耗品是主要成本。优化载量、流速、缓冲液消耗、填料寿命至关重要。考虑连续层析等新技术。

数据分析与建模：利用先进的数据分析工具和机理/统计模型加速开发和优化。

结论

重组蛋白层析工艺开发是一个复杂、迭代且目标导向的系统工程。成功的策略始于对目标蛋白和杂质的深刻理解，并贯穿于捕获、中间纯化和精纯化步骤的精心选择和优化中。始终牢记纯度、收率、稳健性、可放大性、经济性、合规性和病毒安全等核心目标。应用QbD理念、DoE工具、平台化策略和先进技术（如连续层析），结合深入的工艺表征，才能开发出满足商业化生产需求的、高质量、高效率和可持续的层析纯化工艺。

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