炙手可热的双抗赛道，如何实现高效纯化？

双特异性抗体是一种能够同时结合两种不同抗原的抗体分子，跟单抗或混合使用两个单抗相比，双抗因为其独特的生物学机制，在抗肿瘤的临床研究和临床治疗中显示出特异性更高、靶向性更强的显著优势。然而，双抗复杂的表达体系和结构多样性也为其工艺实现带来了巨大挑战，尤其是其下游杂质的去除方法。本文将详细阐述双抗的结构特点及相应杂质，并针对双抗下游纯化工艺的难点给出百林科的解决方案。

2022年是全球双抗步入收获期的一年，4款双抗在全球范围内获批，数量超越了此前总和。随着单抗各靶点不断进入红海竞争状态，国内药企更是已经意识到双抗药物的广阔发展空间，研发热情空前高涨。包括康方生物、百济神州、信达生物、君实生物、宜明昂科、康宁杰瑞等创新药企均在该领域发力。其中，康方生物的首款国产双抗药物卡度尼利单抗一鸣惊人，以亮眼的业绩为业内的双抗研发信心注入了一剂强心针。双抗当下俨然成为了生物医药界最炙手可热的赛道。

由于其独特的生物学机制，双抗相比单抗在治疗效果上具有明显优势。但于此同时双抗也存在诸多缺点，主要包括：

1、链错配（主要包括重链之间错配引起的同源抗体；轻链之间错配引起的异源抗体）

2、Fc片段引发的问题（Fc片段的存留与双抗药物的渗透性、半衰期、稳定性、免疫原性等密切相关）

3、功能性、亲和力、效价等（主要为非IgG-like问题）

此外，双抗结构可以被近一步分为双价双抗（ bivalent, 1+1），三价双抗（trivalent, 1+2 或者2+1）和四价双抗（tetravalent, 2+2）。虽然抗原配对价位的增加可以有效地提高双抗的特异性和靶向性，但同时也给下游工艺开发带来了前所未有的挑战。双抗纯化的主要难点包括 1）杂质组成极为复杂，除了常见的宿主细胞蛋白（host cell protein）和宿主细胞基因（host cell DNA），双抗杂质还包括各式各样错配产物，抗体片段和聚合物；2）配错产物在结构上和物化特性上跟双抗产物非常接近，极难去除；3）杂质量大，错配产物最高可以达到总蛋白表达量的90%以上；4）比单抗相比，双抗更容易发生聚合，尤其是抗体片段双抗。

除了以上问题外，双抗分为非对称双抗和对称性双抗，而根据是否含有Fc片段，非对称双抗又可以分为IgG-like和非IgG-like。对称性双抗C端加另一抗体的可变区。由于链延长，最大的问题，聚集体含量会很高。根据目前发表的文献，高达50%，而在二硫键设计，聚集体含量可降至20%；此外，非对称性双抗在表达过程中会产生多种副产物，主要分为同源二聚体，半抗，多聚体三类。根据不同的副产物纯化工艺的选择有所不同。

640 (1).png

图1：双抗纯化流程图

针对同源抗体和半抗可利用Protien A 层析分担后续纯化去出同源抗体和半抗的压力。一般而言，同源二聚体很难去除，因为其物理化学性质都与目的双抗相似。因此在分子设计上可以通过一些方法区分同源二聚体，如通过亲和力差异性与电荷及疏水性差异来进行纯化。例如通过阻断重链恒定区protein A结合位点的分子设计策略可以有效简化同源二聚体的去除。

图2：可通过PH梯度洗脱达到同源二聚体的去除

产品的相关杂质并不依赖这一步，捕获阶段主要对于工艺杂质HCP、DNA的去除，或保证产品比较高的回收率。但针对双抗副产物比较多的这个情况，我们也是希望让Protein A承担一些的责任，减轻下游去除这些副产物的压力。

640 (3).png

图3：通过条件优化，达到去除半抗的效果

百林科MaXtar ARPA的配基是修饰的耐碱rProtien A，可耐受0.5M NaOH进行CIP，具有高流速，高载量的特性，动态载量>60mg/ml。

640 (4).png

图4：0.5 M NaOH 分别处理0h、12h、24h、48 h处理后MaXtar ARPA动态结合载量均能够维持40 mg/ml以上，且仍可以保持80%以上的初始载量水平。

640 (5).png

图5：MaXtar ARPA运行200个cycle以后，DBC>90%

层析柱：4.7ml（柱高10cm）

样品：人血来源的IgG，6mg/ml

保留时间：上样阶段6min，其余4min

CIP：0.5M NaOH，15min

测试次数：220次

640 (6).png

图6：MaXtar ARPA动态结合载量RSD小于5%

MaXtar ARPA

在双抗项目中的表现

640 (1).jpg

640 (2).jpg

图7: 在收率相当的情况下SEC-HPLC结果显示， MaXtar ARPA与某进口品牌无明显差异

此外，羟基磷灰石CHT在双抗纯化中对与半抗和多聚体的去除拥有良好的表现，对于聚集体不能控制在较低水平的情况，使用BaronCHT type Ⅱ开发可以起到很好的效果，百林科提供高质量的Ⅰ和Ⅱ型羟基磷灰石。 640 (3).jpg

图8：百林科羟基磷灰石球体形貌和晶体结构

参考文献

Bent W., et al., Development of a single-step, protein A chromatography process for bispecific antibodies in early screening. Summlt.

Source：Y.Li., A brief introduction of IgG-like bispecific antibody purification: Methods for removing product-related impurities, Protein Expression and Purification (2019)

Yifeng Li, Ying Wang, Peter (Keqiang) Shen, Weichang Zhou ,A roadmap for IgG-like bispeciﬁc antibody puriﬁcation

Current trends and challenges in the downstream purification of bispecific antibodies

点击这里查看百林科层析填料

上一个

抗体捕获新秀MaXtar ARPA，到底有哪些硬实力？

下一个

P疫苗的多元化解决方案

热门产品