生物药制造中常见的稳定剂和保护剂

引言

生物活性成分（或称活性物质、药物分子）尤其是蛋白质，在生产制造、存储运输及使用过程中会面临相对高温、冻融、机械剪切力、非特异性吸附、表面张力、光解、多种氧化、溶液中分子间的共价键及非共价键（或称非共价相互作用）的形成以及酶解等多种理化生物压力，它们可能发生活性下降、降解、变性、聚集、沉淀、化学修饰中的一种或多种。其中，相对高温、冻融、剪切力、界面吸附及分子间非共价键在产品生产、流通及使用的每个环节都可能引起活性成分结构的变化或聚集。本文主要讨论通过在蛋白类药物生产制造过程中使用稳定剂or/and保护剂，促进活性成分结构的维持。

生物大分子结构的复杂性

作为生物药主要的成药分子，多肽和蛋白质具有众多不同的氨基酸和多种高级结构，使这些生物大分子具有十分丰富的结构。生物大分子的一级结构由共价键维持，高级结构则由多种非共价键协同维持。大分子的整体和局部、内部和表面、连接区和结构域对所处的溶液微环境都有一定要求，它们才能在生产加工过程中保持结构的稳定，最终发挥预期的生物学功能。

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组成蛋白质的20种常见氨基酸（Ausserwöger, H., Schneider, M.M., Herling, T.W. et al. Non-specificity as the sticky problem in therapeutic antibody development. Nat Rev Chem 6, 844–861 (2022)）

非共价键/非共价相互作用

非共价键指键能低于共价键的原子间的相互作用（生物分子中常见的共价键键能一般在300-800 kJ/mol之间），这些相互作用不形成共用电子对，主要通过原子或化学基团间弱作用力实现。生物大分子的分子间及分子内的非共价相互作用主要有以下五种：

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表1：生物大分子的分子间及分子内的非共价相互作用

注：键长越长，键能越弱，分子越容易受外界电场影响发生极化，稳定性也越差。生物分子中共价键键长多在1-1.8 Å‌之间。

蛋白质、DNA和RNA等生物大分子含有大量潜在的氢键位点，以及离子键、范德华力或疏水相互作用位点，以至于这些微小结合力的累积效应可能非常巨大。

对于生物大分子而言，最稳定的结构通常是使弱键结合可能性最大化的结构。单条多肽链或多核苷酸链折叠成其三维形状的过程正是由这一原理决定的。
溶液中分子与生物大分子间的这些短程作用力则在维持高级结构起作用。
不同生物大分子（蛋白-蛋白）之间相互作用，发挥生物学功能也通过特定一种或几种非共价相互作用来实现。
此外，大分子之间的非特异性相互作用，如聚集行为也多由非共价键促成。

蛋白质保护剂/稳定剂

多元醇（Polyol）

分子中含有二个或二个以上羟基的一大类醇类。多元醇一般溶于水，对极性物质溶解能力强，是毒性和挥发性小的黏性液体或结晶状固体。

常温溶液状态下，多元醇的稳定或保护作用的机制：主要源于‌静电相互作用‌诱导甘油等共溶剂在蛋白质表面特定取向，导致甘油被进一步‌排开，形成优先水化层。上述相互作用推动天然态蛋白向‌更紧实的构象‌转变，提升热力学稳定性。甘油选择性结合‌连续的大面积疏水区域‌，充当疏水表面与溶剂水间的‌两亲界面‌；既‌可抑制蛋白去折叠‌，又通过稳定有聚集倾向的中间体防止其进一步聚集和沉淀。‌

低温溶液状态下，甘油通过多羟基与水分子形成氢键，抑制冰晶成核与生长、降低溶液冰点，并屏蔽疏水相互作用，从而防止低温诱导的蛋白变性、聚集及机械损伤‌。‌‌高浓度甘油（如 50%）可使溶液在-20℃仍保持液态，彻底避免冻融循环损伤。‌‌常见于酶的保存。

固体（冻干）制剂中，在脱水过程中小分子多元醇能渗透进入蛋白质表面，与极性基团形成氢键，‌替代被移除的水分子‌，防止因失去水分子导致的氢键断裂和空间结构坍塌。高浓度甘油在干燥后期形成高黏度‌无定形玻璃态基质‌，大幅降低分子扩散速率，抑制蛋白质链段运动、聚集及构象松散。

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表2：蛋白质保护剂/稳定剂

糖（Sugar）

此类稳定剂/保护剂主要是非还原性二糖。糖类对蛋白质的稳定机制与多元醇相似。

常温溶液状态下，糖分子倾向于被排除在蛋白质表面附近，这增加了蛋白质表面的表面张力，促使蛋白质折叠成更紧凑的天然构象以降低表面能，从而提高热力学稳定性。

在冻干过程中，糖的羟基可以替代水分子与蛋白质表面的极性残基形成氢键，维持蛋白质的二级和三级结构，防止因失水导致的结构崩塌。在高浓度或干燥条件下，糖分子能形成高粘度的无定形玻璃态基质，极大地限制蛋白质分子的运动自由度，抑制化学降解和物理聚集的发生。

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表3：蛋白质保护剂/稳定剂

需要注意的是，这些稳定剂/保护剂的工作浓度往往以百分含量来计，但也有研究以稳定剂：蛋白的质量分数（W/V）或摩尔比来计算。而且保护效果与蛋白分子及其保存温度有关（比如，避免溶剂结晶析出），多种稳定剂/保护剂也时常组合使用。

根据溶液中与生物大分子的非共价相互所用，在生产纯化过程中也可以使用这些试剂降低或屏蔽目的蛋白与杂质的相互作用，起到辅助纯化的作用，尤其是在背景成分极为复杂的情况下。

药物安全对稳定剂/保护剂的使用的限制

在众多保护剂/稳定剂中，功能性药用辅料为主动添加成分，并非工艺杂质，不适用”残留量“的概念，‌适用含量测定与处方符合性‌评价。反之，在生物药制造过程中添加而非产品中主动添加的成分即原料，则应基于安全性评估进行残留量的限制。无论原料还是辅料，都应建立质量标准。

结语

综上，生物药生产制造实践中，需要考虑使用蛋白稳定剂/保护剂的效果、使用中的可生产性、安全性、合格供应商数量以及物料成本。此外，还应考虑对环境的潜在影响。

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