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猪圆环疫苗的纯化工艺介绍


兽用疫苗是我国兽用生物制品最重要的组成部分,兽用疫苗销售额占兽用生物制品销售额的比例均超过90%,国内兽用疫苗销售规模年均复合增长率为8.03%,高于国外水平,系国外兽用疫苗较国内更成熟。2018年我国兽用疫苗市场规模为120亿元左右,其中猪用疫苗52.5亿元,禽用疫苗42.18亿元。预计2023年兽用疫苗市场规模可达250亿元左右。


根据《国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020年)》,我国优先防治的国内动物疫病中的一类疫病有口蹄疫、高致病性禽流感、高致病性猪蓝耳、猪瘟、新城疫。从猪用疫苗终端价格来看,猪圆环苗价格相对较高,市场苗价格在9-18元/头份左右。


目前共有53家生产企业获得过猪圆环疫苗的生产批准文号,其中2021年和2022年共新增9家。目前猪圆环疫苗的研究方向主要是灭活疫苗以及基因工程重组疫苗。猪圆环病毒疫苗(porcine circovirus,PCV)有两个血清型PCV-1和PCV-2,其中PCV-1为非致病性的病毒,PCV-2为致病性的病毒。


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      表格来源于:兽用疫苗行业研究



市面上猪圆环灭活病毒疫苗一般采用的宿主细胞为PK15,它需要通过微载体进行悬浮培养,通过增值获得病毒后,进行灭活处理以及纯化,超滤等步骤得到猪圆环灭活疫苗。猪圆环灭活病毒的生产工艺主要为凝胶过滤或者分子筛层析,根据病毒颗粒与杂质分子量的差异,采用4FF或6FF等凝胶过滤介质进行组分分离,从而达到分离猪圆环病毒与杂蛋白的目的,随着新型的复合模式填料的推出,COll 400 也可以作为分子筛的替代方案,以提高生产效率。灭活的猪圆环工艺步骤可以总结如下图:


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另外可以采用昆虫细胞杆状病毒真核表达系统,其中Cap蛋白是PCV2病毒粒子唯一的结构蛋白,蛋白分子量大小约32kDa,自动组装成稳定的VLPs(高纯度病毒样颗粒抗原),具备更好的免疫原性。其中Cap 蛋白为碱性蛋白,一般在细胞培养结束后,经过澄清过滤后,采用一步高分辨率的阳离子进行捕获,比如MaXtar SP HR已经证明可以很好的用于Cap蛋白的捕获。


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应用案例:


MaXtar SP HR高效捕获猪圆环Cap蛋白

平衡Buffer: 20mM PB+0.1M Nacl 

上样:澄清过滤收获液10-20CV

洗脱Buffer: 20mM PB+0.4-1M Nacl


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图1:MaXtar SP HR层析图谱


经过一步纯化后Cap2 的纯度可以达到87% 以及更高的水平。


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图2:MaXtar SP HR层析后SDS-PAGE以及HPLC分析


小结:

通过SDS-PAGE检测可见杂带较少纯度较高,通过HPLC-SEC图可见纯度为87.3%,由此可见猪圆环Cap蛋白通过一步MaXtar SP HR纯化后可满足纯度要求,另外MaXtar SP HR 因为期高刚性,比较适合用于工业化生产放大。


MaXtar SP HR的特点与优势

MaXtar SP HR是一款高分辨率的强阳离子交换层析介质,利用不同分子在特定条件下电荷性质和多少的差异对其进行分离。

1、改良的 MaXtar 基架具有更强刚性,因此在较低的反压下能够实现更高工艺流速,提高工艺效率。

2、通过升级配基偶联方式,提高层析介质的动态结合载量。

3、更细的颗粒粒径,提高层析介质的分辨率。


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