纯化小技巧 | 面向复杂抗体时代的下一代 Protein A 平台

Protein A 亲和层析长期以来始终是抗体工业下游纯化过程中的核心技术，凭借其高效的选择性捕获能力，已成为单克隆抗体纯化流程中不可或缺的步骤。然而，随着生物制药技术的飞速发展，双特异性抗体（Bispecific Antibody）、Fc 工程化抗体、抗体药物偶联物（ADC）以及 Fc 融合蛋白等复杂抗体形式迅速涌现，传统 Protein A 平台逐渐暴露出结合异质性、耐碱性不足、动态载量受限以及对复杂抗体适配性差等问题。这些挑战推动产业界加速创新，近年来，针对 Protein A 的结构工程、耐碱改造、高载量偶联技术、双抗专用配基以及人工智能辅助蛋白设计等领域已成为研发热点。本文系统综述了不同 Protein A 结合模式、IgG 亚型及双特异性抗体对亲和层析行为的影响机制，总结了高载量 Protein A 填料的核心设计逻辑，并探讨了未来新型亲和填料的发展方向，以期为下游工艺优化提供参考。

Protein A 的结构基础与工业地位

天然Protein A 来源于金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），由 E、D、A、B、C 五个同源 Fc 结合结构域构成，每个结构域均能独立与抗体的 Fc 区域结合。其中，B 结构域因结构稳定、易于表达且便于工程改造，已成为工业 Protein A 配基开发的核心模板，广泛应用于商业化填料的制备。Protein A 与抗体 Fc 区域的结合主要位于 CH2-CH3 界面，其结合驱动力涵盖疏水相互作用、氢键、静电作用及空间构象匹配，这种特异性相互作用确保了高效捕获。

在现代生物制药工业中，Protein A 捕获步骤通常在整个下游纯化流程中实现幅度最大的目标蛋白纯度提升，可一步去除大部分宿主细胞蛋白、DNA 及病毒等杂质。其高选择性决定了 Protein A 目前仍是绝大多数治疗性抗体工业生产中的第一步核心工艺，为后续层析步骤奠定了基础。

不同抗体对Protein A 结合的挑战

不同 IgG 亚型与Protein A 的结合特性

不同 IgG 亚型与 Protein A 的结合能力存在差异，这源于各亚型 Fc 区域结构的细微差别。在实际抗体纯化过程中，这些差异表现为不同的结合特性与结合载量，直接影响工艺效率。通常，针对肿瘤相关靶点（如 EGFR、Her2）的抗体多为 IgG1 亚型，而针对免疫相关靶点（如 PD-1、PD-L1）的抗体则多为 IgG4 亚型。IgG1 与 Protein A 的亲和力较强，载量较高；而 IgG2 和 IgG4 的结合较弱，可能导致动态载量下降。此外，抗体的糖基化修饰、电荷变体等因素也会影响其结合行为，需在工艺开发中进行针对性优化。

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表1：不同 IgG 亚型与Protein A 结合差异

Fc 工程与双抗时代对 Protein A 的挑战

近年来，抗体研发已从传统单克隆抗体逐渐转向复杂结构抗体，包括 Knob-into-hole（KIH）双特异性抗体、CrossMab、IgG-scFv、DVD-Ig 及 Fc-silent 抗体等。这些复杂结构往往伴随着 Fc 区域构象的变化，从而直接影响 Protein A 的结合行为。

例如：

KIH 双抗由于 CH3 区异源二聚化，可能导致 Protein A 结合界面不对称，从而降低亲和力；
CrossMab 会引入空间位阻，影响配基的可及性；
Fc-silent 抗体通过突变削弱 Protein A 亲和力，以减少效应功能；
IgG-scFv 在低 pH 洗脱条件下易形成聚集体，增加产物损失。

因此，同一款 Protein A 填料在不同双特异性抗体中的动态载量（DBC）差异可能高达 2-3 倍，这对平台化纯化策略提出了更高要求。

在抗体FC的工程改造中，很多突变对蛋白A是有明确影响的。例如，Fc 区域的点突变（如 L234A/L235A 去糖基化突变或 YTE 延长半衰期突变）可能改变表面电荷或疏水性，从而干扰 Protein A 的结合；工程化 Fc 融合蛋白（如受体-Fc 融合体）也可能因结构刚性导致结合不稳定。

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表2：不同Fc改造与 Protein A 结合差异

Protein A 填料改造

Protein A 耐碱改造的发展

传统Protein A 的主要工业缺陷之一在于其耐碱性不足。在工业生产中，通常需使用 0.1–0.5 M NaOH 进行原位清洗（Cleaning in Place, CIP）以去除残留污染物和微生物，而 Protein A 在此条件下极易发生脱酰胺、异构化及结构去折叠，导致配基失活和填料寿命缩短。

其典型的敏感位点包括( Asn-Gly/Asn-Ser 序列以及富含 Asp 的环状区域，这些区域在碱性条件下易于发生化学降解。为应对这一挑战，产业界已开发出多种耐碱突变体，新一代工业配基广泛采用 Asn 消除策略（例如将 Asn 替换为 Gln 或其他稳定氨基酸），使得填料能够耐受数百次 NaOH CIP 循环，从而显著降低生产成本。

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表3 ：主流耐碱 Protein A 改造策略

高载量Protein A 的核心逻辑

过去，行业普遍认为提高配基密度即可提升动态载量（DBC），但近年来的研究表明，真正决定 DBC 的核心因素并非“偶联量”，而是“有效可及结合位点”。由于 IgG 分子的尺寸约为 10–14 nm，当配基密度过高时，反而会导致以下问题：

空间位阻限制抗体接近；
多点吸附造成洗脱困难；
孔道拥堵影响传质效率。

因此，新一代高载量 Protein A 填料更注重以下设计原则：

采用不同类型间隔臂设计以增强配基柔性，提高可及性；
通过定向偶联确保结合界面充分暴露；
使用高刚性合理孔径基质以促进抗体扩散；
Protein A 的改造需要保留较全面的结合特性。

双抗专用Protein A 的未来方向

随着双抗药物数量快速增长，Protein A 已从“通用IgG配基”逐渐转向“复杂抗体专用平台”。针对双抗的未来开发将重点关注除杂能力与产物稳定性，聚焦特殊双抗的结合载量优化，以应对异质体去除和产物聚集等挑战。发展方向包括：

高pH温和洗脱

可减少双抗聚集与构象破坏，开发可实现温和洗脱的Protein A配基，能够在温和条件下洗脱目的产物，百林科温和洗脱填料能够于pH 4.5及以上的温和条件下实现对聚集体的高效控制。

案例分享：

样品：双抗( load:40 mg/ml)
Elution Buffer ：50mM NaAC-HAC pH 4.5

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图1、2：双抗纯化图谱及检测

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表4：双抗纯化后质量数据

类蛋A结合（CH3/CH1 /Pro-L/Fab亲和配基)

可用于区分正确组装的双抗与 half-antibody，或应对Fc工程导致Protein A结合载量大幅降低的情况。新型纳米抗体与多肽配基等亲和配体已得到应用，此类配基尺寸小、稳定性高，可靶向特定表位，增加更多选择。

AI 辅助界面定制化设计

可借助大模型，实现Protein A填料各模块的协同智能化与可预测化设计，结合 AlphaFold、RFdiffusion、ProteinMPNN 等工具快速预测突变热点与结合界面，结合目的抗体特点，快速定制Protein A填料（白球，偶联方式，蛋白A展示），为抗体项目提供服务，实现个性化纯化解决方案。

未来趋势：

Protein A 迈向智能化平台时代

未来，Protein A 领域的竞争已不再仅局限于动态结合容量（DBC）的比拼。决定平台竞争力的核心要素将涵盖以下方面：